玉足吧 基于环介导恒温扩增工夫的大肠杆菌O157:H7快速检测试剂盒的评价

大肠杆菌(Escherichia coli) O157:H7是肠埃希氏菌中血清型毒力较强的菌种代表，激励以泻肚为主的动物源性传染病[1-2]。大肠杆菌O157:H7传播门道稠密，包括食源性传播、水源性传播以及东说念主畜宣战传播等，其中以食源性传播更为普遍[3]。连年来，我国大无数地区均出现大肠杆菌O157:H7感染疫情，一般为患病者进食被该致病菌玷污的食物所致，何况发达出较着的季节性暴发玉足吧，多集合在7-9月[4-6]。大肠杆菌O157:H7可感染通盘年岁阶段的东说念主群，至极是儿童和老东说念主发病率较高，何况会激励多种严重的并发症，如溶血性尿毒空洞征(HUS)和血栓形成性血小板减少性紫癫(TTP)，具有毒力强、病死率高级特质[7-8]。截止当今，尚未发现存退避大肠杆菌O157:H7感染的疫苗，因此磋商该菌感染疫情的截止多集合在对食物、水源等的早期检测方面。现时已诞生了多种大肠杆菌O157:H7检测要领，主要包括继承传统培养基法(病原微生物分离遒劲、形态学遒劲及自动化遒劲要领)、酶联免疫工夫、核酸探针工夫、核酸扩增(PCR)工夫等[9-10]，但这些要领发达出检测周期长、操作复杂、仪器崇高、老本高级不及，何况多局限在实验室检测，难以餍足不才层现场的快速检测需求。

环介导恒温扩增工夫(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由Notomi就是2000年开采的一种新式的体外等温扩增特异核酸片断的工夫[11-12]。该工夫利用两对非常引物和具有链置换活性的Bst (Bacillus stearothermophilus) DNA团员酶，能在65℃阁下恒温条款下使引物班师与模板荟萃并进行链置换扩增反映，无需复杂仪器，大大省俭了反映时期，其末端判读、聪敏度、特异性、检测边界及应用老本等远优于其他分子检测要领，因此基于该工夫的检测居品将更适用于下层单元的快速检测需求。鉴于此，凭据我国现存关系质检行业尺度工夫文献，本磋商对研制的基于LAMP工夫的大肠杆菌O157:H7快速检测试剂盒的性能和检测质地水平进行测试和评价。登第不同分娩批次的试剂盒，对该试剂盒检测大肠杆菌O157:H7的特异性、聪敏度、准确度、类似性、保质期及运载相识性等进行分析，评价了该试剂盒用于各类不同食物样品的大肠杆菌O157:H7检测的适用性。

1 材料与要领 1.1 主要材料和试剂

E. coli O157:H7 ATCC 35150、E. coli O157:H7 ATCC 43889、E. coli O157:H7 ATCC 700728、E. coli O157:H7 NTCT 12900、E. coli O157:H7 CMCC(B) 44828、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ATCC 25923、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri) CMCC(B) 51572、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) ATCC 9027、粪肠球菌(Enterococcus faecali) ATCC 29212、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii) ATCC 29544、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus) ATCC 17802、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogene) ATCC 19115、肠炎梵衲氏菌(Salmonella enteritidis) ATCC 13076、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes) ATCC 13048、乙型溶血性链球菌(Beta-hemolytic streptococcus) ATCC 21059、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CMCC(B) 63501、E. coli CMCC(B) 44102和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae) CMCC(B) 31001均由广东环凯微生物科技有限公司提供。

大肠杆菌O157:H7的LAMP快速检测试剂盒共5批次(分歧为20150313、20150412、20150511、20150610、20150712)，由本实验室研制，其中枢构建组分包括干粉试剂、复溶液、显色液、裂解液、阳性对照、阴性对照。胰卵白胨大豆琼脂(TSA)、纠正EC肉汤(mEC)、纠正山梨醇麦康凯琼脂培养基(CT-SMAC)、三糖铁琼脂(TSI)、月桂硫酸盐胰卵白胨肉汤-MUG (MUG-LST)、氧化酶试剂、革兰氏染色液、大肠杆菌O157:H7会诊血清、MID生化遒劲试剂盒、半固体琼脂、O157显色琼脂由广东环凯微生物科技有限公司提供。

供试食物样品在宇宙8个地区(澳门、郑州、乌鲁木皆、杭州、南京、石家庄、银川及呼和浩特)进行抽样，包括肉与肉成品、蔬菜以及速冻食物共3类14种代表性食物。

1.2 主要仪器

Shock Mixer-1型高速回荡样品措置器、HKP-9172A型恒温培养箱、WBK-4B水浴恒温箱，广东环凯微生物科技有限公司；3K15型台式高速离神思，德国Sigma公司；DYY-6B型稳压稳流电泳仪，北京市六一仪器厂；Easy Spiral型螺旋接种仪，法国Interscience公司。

伦理小说在线阅读 1.3 要领

1.3.1 尺度菌株DNA样品制备: 取各个菌的崭新培养物，挑取半环菌落置于50 μL裂解液，充分悬浮后99 ℃水浴15 min，12 000 r/min离心10 min后取上清，即为粗提尺度菌株DNA样品，-40 ℃保存备用。

1.3.2 试验样品DNA制备: 从各地汇集的样品中每份取25 g置于225 mL mEC肉汤，凭据GB/T4789.36-2008《食物微生物学覆按大肠杆菌O157:H7/NM覆按》[13]要领进行前措置及增菌，取增菌液1 mL到1.5 mL无菌离心管中，6 000 r/min离心5 min；弃上清，加入30 μL裂解液，悬浮后99 ℃水浴15 min，12 000 r/min离心10 min，取上清，即得样品粗提DNA，-40 ℃保存备用。

1.3.3 特异性试验: 用5株大肠杆菌O157:H7尺度菌株和13株非大肠杆菌O157:H7尺度菌株，分歧制备其DNA样品。每份尺度菌株DNA样品继承3个平行测试，操作要领严格按照试剂盒评释书(_105017001_100001015_100111153991255.html)进行，并与试剂盒所提供的阳性样品对比，反映后的反映液呈荧光绿色为阳性，浅橘红色为阴性。

1.3.4 聪敏度试验: 取大肠杆菌O157:H7尺度菌株NTCT12900崭新培养物，挑取一环菌落置于30 mL生理盐水中，回荡摇匀，使菌体均匀悬浮其中，并经生理盐水梯度稀释，稀释倍数分歧为100、101、102、103、104、105、106、107、108倍，分歧取以上不同稀释倍数的稀释液50 μL进行螺旋计数。同期取以上不同稀释倍数的稀释液制备DNA样品，具体要领为：分歧取各个稀释倍数的稀释液50μL置于200 μL预灭菌PCR管中，6 000 r/min离心5 min；弃上清，加入12.5μL试剂盒中提供的裂解液，充分悬浮后经99 ℃水浴15 min，12 000 r/min离心10 min，取上清即得到各个稀释倍数的菌液所对应的DNA粗提样品。用大肠杆菌O157:H7快速检测试剂盒，取以上粗提DNA样品2.5 μL进行测试，其中每份DNA样品继承8个平行测试，与试剂盒提供的阳性样品对比，反映后的反映液呈荧光绿色为阳性，浅橘红色为阴性。另外，经琼脂糖凝胶电泳检测不雅察各个样品反映情况，与计数末端进行对比，并狡计最低覆按限。菌落计数方式参照GB4789.2-2010《食物微生物学覆按菌落总额测定》[14]，该试剂盒最低覆按限(CFU)=(本试剂盒检测能检测到的最高稀释倍数的50 μL菌液对应的含菌量)/5。

1.3.5 试验样品检测: 取25 g经措置事后的样品置于225 mL mEC肉汤中，36±1 ℃分歧培养10 h和18 h。取10 h的培养液经热裂解法得到DNA样品，用LAMP试剂盒进行测试。取18 h的培养液参照GB/T4789.36-2008要领进行测试，并对可疑菌落进行遒劲，然后进行统计分析。具体包括：(1) 检出特异性=该试剂盒检测和传统检测要领均为阴性末端例数/传统检测要领为阴性末端例数×100%；(2) 检出聪敏度=该试剂盒检测和传统检测要领均为阳性末端例数/传统检测要领为阳性末端例数×100%；(3) 检出准确度=(该试剂盒检测和传统检测要领均为阳性末端例数+该试剂盒检测和传统检测要领均为阴性末端例数)/被检测通盘样品例数×100%，即暗示该试剂盒检测和传统检测要领末端的一致性。

1.3.6 类似性考证: 参照1.3.4的聪敏度检测末端，登第大肠杆菌O157:H7尺度菌株NTCT12900崭新培养物，挑取一环菌落置于30 mL生理盐水中，回荡摇匀，使菌体均匀悬浮其中，并进一步经生理盐水稀释为101和105倍，经热裂解法得到相应的DNA样品，分歧看成高菌量和低菌量标的菌检测样品，另外取无菌生理盐水看成阴性检测样品。用以上5批试制的检测试剂盒，每个批次分歧取以上高菌量的标的菌检测样品、低菌量的标的菌检测样品及阴性检测样品各2.5 μL进行测试，每份DNA样品继承10个平行测试，其中，批间或批内检测类似性=批间或批内检测得当数/检测总额×100%。

1.3.7 保质期考证: 取5批试制的检测试剂盒置于4 ℃保存，分歧于保存后1、3、6、9和12个月进行立时检测，均取1.3.6中的低菌量标的菌样品看成检测样品，每个批次的试剂盒取10个平行测试。

1.3.8 相识性考证: 将5批试制的检测试剂盒与冰袋同期置于泡沫盒中，在42 ℃下储存96 h，每24 h对各个批次的检测试剂盒抽检一次，均取1.3.6中的低菌量标的菌样品看成检测样品，每个批次的试剂盒取10个平行测试。试剂盒中心的温度变化见图 1。 1.4 统计学要领

继承SPSS 19.0软件进行统计学整理和分析，计量贵府以尺度差(x±s)暗示，进行t覆按，计数贵府则行χ2覆按，P＜0.05暗示相反有统计学真谛。

2 末端与分析 2.1 特异性试验

5株大肠杆菌O157:H7尺度菌株样品均披露较着荧光绿色，即为检测阳性；而13株非大肠杆菌O157:H7尺度菌株样品仍为反映前的浅橘红色，即为检测阴性，而且以上平行测试末端一致，见表 1和图 2。

2.2 聪敏度试验

稀释倍数在100-106时，对应的检测管均披露较着荧光绿色，即为检测阳性；而稀释倍数在107-108时，对应的检测管仍为反映前的浅橘红色，即为检测阴性，见图 3，以上平行测试末端一致。

经琼脂糖凝胶电泳检测以上不同菌量样品对应的反映产物，如图 4所示，低于稀释倍数106的样品均能披袒露现较着的梯状条带，末端标明该试剂盒最低覆按限为29 CFU (稀释倍数为106)。

2.3 与传统检测要领对比磋商

通过对3类14种代表性食物进行检测，末端披露，在肉与肉成品、蔬菜和速冻类食物中，该试剂盒联系于传统检测要领的检出聪敏度均为100%，检出准确度分歧为89.6%、96.9%和93.8%，总体的检出准确度为92.9% (表 2)，总体上两种要领的检测末端具有较高的一致性，具体数据见表 2和表 3。

2.4 类似性考证

对高菌量的标的菌和阴性菌样品的检测中，该试剂盒批间以及批内检测类似率均为100%；对低菌量的标的菌样品的检测中，5批试剂盒批内检测类似率分歧为90%、90%、100%、100%和90%，批间检测类似率为94%，见表 4。

2.5 保质期考证

保质期内各个月份的通盘检测反映后均能出现较着荧光绿色，不同保存时期段的检测遵守均为100%，批间相反不较着(P＞0.05)，见表 5。

2.6 相识性考证

模拟不同时代段的通盘检测反映后均能出现较着荧光绿色，不同储存时期段的检测遵守均为100%，批间相反不较着(P＞0.05)，见表 6。

3 磋商

LAMP工夫是一种新式核酸扩增工夫，鉴于其恒温、高效等特质，扩增遵守大大优于PCR工夫。但其反映体系愈加复杂[15]，一般需要将各个因素设置成关系溶液，以至操作繁琐。加之LAMP反映普遍较PCR更为聪敏，应用过程中防护玷污相称必要，而过于无为的操作也易导致关系试剂、检测区间的玷污，以至假阳性末端的发生。另外，在LAMP反映体系中，部分试剂需要冷冻储存(如LAMP引物、dNTPs、Bst DNA团员酶)，尤其是其中枢因素Bst DNA团员酶要求在-20 ℃条款下储存，

温渡过高会径直形成酶活性丧失，从而无法达到检测遵守。本磋商通过工艺联想，将试剂盒中需要冷冻储存的试剂进行干粉化。保质期考证实验标明，该试剂盒在4 ℃条款下能保存较万古期(9个月)，但不提议保存更万古期；短期温度变化(0-42 ℃)相识性考证实验标明，该试剂盒能妥当较万古期(多达72 h)以及较高温度(42 ℃)环境存储，相识性较好，从而便于资料运载，但为保证检测遵守，不提议永恒储存以及过万古期运载。总体上，该试剂盒能妥当高温资料运载，其使用操作也大大简化，裁减了相应老本，便捷现场应用。另外，对LAMP反映末端的判读，之前关系磋商中多有说起，主要包括经琼脂糖凝胶电泳检测不雅察其反映产物梯状条带，以及经肉眼径直不雅察反映产物，如LAMP反映体系中的Mg2+会与反映产物焦磷酸荟萃形成焦磷酸镁，产生白色混浊物，但或然该浊度未便不雅察，需借助仪器匡助；反映产物双链DNA可荟萃荧光染料SYBR Green I染色，如有扩增产物时，反映变绿色，反之，仍为橙色。但该染料价钱较高，且操作时需反映后开盖加入，会形成出奇的气溶胶玷污[16]，可能影响其他反映末端。本磋商中继承经配比优化的钙黄绿素-Mn2+教授剂，价钱便宜、花样不雅察遵守较着，且在反映前加入教授剂，使末端判读愈加便捷、可靠。

传统大肠杆菌O157:H7覆按参照GB/ T4789.36-2008[13]，如一般被期骗的通例培养法是凭据大肠杆菌O157:H7的培养秉性、形态学特征、生化特征、血清学试验进行属(种)的遒劲；免疫磁珠拿获工夫是通过对大肠杆菌O157:H7进行遴选性的增菌，然后利用免疫磁珠进行遴选性拿获，后将磁性颗粒涂布到遴选性琼脂平板上进行分离。以上过程操作复杂且耗时长(一般3-5 d)，且需要各式试剂及培养基等，大大提升了检测老本。另外，尺度中提到的全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法是基于在自动VIDAS仪器上进行双抗体夹心酶联荧光免疫分析的检测要领；全自动病原菌检测系统筛选限定是利用PCR扩增并检测细菌DNA中特异性片断来判断标的菌的存在，以上均需要复杂的试剂及仪器，操作过程以及末端判读复杂，尤其是难以不才层覆按单元奉行。然则本试剂盒是针对大肠杆菌O157:H7靶基因联想引物，在恒温条款下可达到快速扩增，通盘检测过程浅薄(前期仅需通过热裂解得到食物样品DNA，加之试剂反映时期仅需50 min阁下)，何况可径直通过肉眼不雅察得出末端，加之本实验考证末端也标明该试剂盒的特异性、聪敏度、准确度、类似性等目的均较好。

此外，利用本试剂盒与传统检测要领对汇集自各个地区的试验食物样品进行同步检测，其末端具有较高的一致性。无为食物中的大肠杆菌O157:H7含量较少[17]，因此在试验检测中有可能因样品汇集不当、增菌遵守欠安等因素导致漏检[18]，而GB/T4789.36-2008[13]中提到通过应用免疫磁珠拿获法对样品中标的进行富集，以提升其检测遵守[19]玉足吧，本试剂盒改日也有望通过与免疫磁珠拿获法相荟萃，并进一步优化检测末端。总之，本磋商参照商品化食物检测试剂盒评价要领[20]和食物微生物覆按要领说明工夫设施[21]提供的评价决策，证实了该试剂盒大要餍足不才层现场快速检测的需求，具有广大的应用出息。